核酸純化前應了解的常見問題

發布時間:2017-07-27

1、  在提核酸前,對實驗樣品你應該知道什么?

樣品的核酸含量、酶含量、特殊雜質含量。

絕大情況下,使用新鮮樣品可以獲得最好的結果,但對一些雜質含量高的樣品,-20℃保存一天后抽提,可能會有更好的效果。樣品如果因為某些原因必須先行保存,也要先簡化一下樣品:血液最好只保存有核細胞;將樣品分割后保存,避免反復凍融;如果實驗室不具備合適的保存條件,可將樣品先裂解后再保存。

2、  怎樣選擇裂解方法?

⑴  含蛋白酶的裂解方法,可以認為是抽提基因組 DNA 的首選。某些樣品,如肌肉,即使是 RNA 抽提,也強烈建議使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某個時候使用蛋白酶消化蛋白質) ,原因在于這些樣品中的蛋白質,是非常難以去除的。該方法是獲得最大得率和最高純度的基礎。

⑵  不使用蛋白酶的去污劑裂解方法,仍然在細胞基因組 DNA 抽提方面有優勢,尤其是當得率和純度要求不是最高,而經濟性及操作簡單很重要時。

① 高濃度蛋白質變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法,是抽提 RNA 的首選。高濃度蛋白質變性劑能快速破壞細胞膜,進而迅速抑制住細胞內的 RNA 酶,從而確保了 RNA 的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品 – 主要是植物,其它絕大部分樣品的 RNA 的抽提,都可以以高濃度的蛋白質變性劑為基礎的。該方法也可用于基因組 DNA 抽提,非常快速簡單,但純度不是很高。
  ② 含 CTAB 的裂解液,幾乎成為富含多糖的樣品,如細菌、植物的基因組 DNA 抽提的首選裂解方法。該方法成功與否與兩個因素有關:一是 CTAB 的質量,二是洗滌的徹底程度。CTAB 的質量對裂解效率有很大的影響,而且,似乎還說不清楚原因,因為即使是同一公司生產的純度一樣的 CTAB,批號不同,效果就可能差別很大。洗滌去除 CTAB 要比其它的鹽難一些,同時, CTAB 的少量殘留也會對酶活性有巨大影響,所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關鍵。裂解時的溫度,多使用 65℃;但如果發現降解嚴重或者得率太低,可以試一下 37℃ – 45℃ 這個相對低溫的區域。
  ③ SDS 堿裂解法是質粒抽提的首選裂解方法,具有快速、得率高、幾乎無基因組 DNA 污染的特點。控制好裂解液/菌體的比例和操作的溫和是該方法成功的關鍵。蛋白質的沉淀效率在 4℃會更好一些,所以,加入溶液 III 后在4℃靜置一段時間以及采用4℃離心去蛋白質,都可以提高質量。該方法不一定要使用 PC 純化,但結合 PC 純化,可以獲得純度很高的質粒。RNA 的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A (100μg/ml) 或者在最后的溶解液中加入 RNase A (25 μg/ml) 來實現。總的感覺是,在溶液 I 中使用 RNase A,RNA 的殘留少一些。不過,經典沉淀幾乎沒有辦法徹底去除 RNA 殘留。另外,對大質粒 (50 kb 以上),該方法可能會有問題。

3、  不同純化方法之間有什么不同?

⑴  PC 抽提/醇沉淀方法,是一個永不過時的方法。穩定、可靠、經濟、方便。PC 抽提可以徹底去除蛋白質,醇沉淀可以去除鹽,對于一般的干凈的樣品 (雜質為蛋白質),該方法完全可以獲得高質量的核酸。PC 抽提的關鍵是,一要混勻徹底,二要用量足夠。徹底混勻,才能確保苯酚與蛋白質的充分接觸,使蛋白質完全變性。許多人總是擔心混勻的劇烈程度是否會對核酸,尤其是基因組 DNA 造成破壞,實際上大可不必如此小心。劇烈的混勻操作,是會部分打斷大分子的基因組 DNA,但該破壞作用不會強烈到 DNA 變成 10kb 以內的小片段。手劇烈晃動混勻后,基因組 DNA 的片段,大部分會大于 20kb,這個大小,除了一些特別的要求外,對 PCR 和酶切,都是完全適用的。如果要求的片段非常大,如構建文庫用,則不能使用劇烈的混勻方法,而只能來回溫和顛倒混勻──此時的關鍵是:裂解液的比例要足夠大,使體系不要太粘稠。用量要足夠,是因為苯酚去除蛋白質是有一定的飽和度的,超過了該飽和度,裂解體系中的蛋白質不會被一次去除,必須靠多次抽提,方可徹底去除。另外,體系太粘稠的壞處是,蛋白質難以徹底去除,以及基因組 DNA 會斷裂得更厲害,所以要注意裂解液與樣品的比例。PC 抽提的另外一個用途是,利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特點,在 RNA 抽提時獲得 DNA 殘留極少的 RNA。不過有一點要提醒的是,有些植物樣品,在去除某些雜質之前,是不能使用 PC 抽提的,否則核酸必定降解。總之,該方法的最大的問題是不適合大規模抽提。
⑵  高鹽沉淀蛋白質/醇沉淀方法,與 PC 抽提方法相比,除了純度的穩定性可能要低一點外,該方法幾乎克服了 PC 抽提的所有缺點。更快、更輕松去除蛋白質所伴隨的好處是,可以用于大規模抽提,不足是純度 (蛋白質殘留) 不夠穩定。蛋白質的沉淀效率在 4℃會更好一些。
⑶  介質純化方法,是一個越來越受到重視的方法。其最大特點是非常適合大規模核酸抽提,并且因為受人為操作因素影響小,純度的穩定性很高 (雖然純度不一定比PC 純化方法更高)。其致命弱點是樣品過量。介質可以分為兩大類,一類是柱式的,即介質被預先裝填在下面是通的柱子里;另外一類則是顆粒狀 (如Glassmilk、磁性小珠等)。顆粒狀的介質的純化操作與經典的醇沉淀差別不大,都是通過數次的加液-倒液過程,干燥后,溶解即可獲得純化好的核酸。柱式純化的操作雖然也是有加液-倒液過程,但因為加入的液體通過離心后會進入另外一個離心管中,與含有核酸的柱子完全是分開的,所以洗滌更徹底,操作更省力 (不用操心將核酸倒掉了,或者液體的殘留)。不過,介質純化方法的成本是最高的,而目前核酸純化試劑盒也多為此方法。

4、 醇的沉淀

⑴  醇的沉淀,目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來,從而實現核酸與其它雜質 – 主要是鹽 – 的分離。實際操作中,許多雜質也會與核酸一起被醇沉淀下來,尤其是當其它雜質的濃度也比較高的時候。醇的沉淀并不是非常特異性的,任何有機大分子及一些鹽,當濃度達到一定水平后,都可能同步被沉淀下來。如果核酸抽提的起始樣品是比較“臟”的,原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率:當核酸濃度很低時,效果明顯;當核酸濃度比較高時,效果不明顯,但卻會導致雜質的大大增加。TRIzol 提供的一個沉淀方案:一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇,可以大大降低多糖殘留。
⑵  PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。雖然它們遠沒有醇沉淀的高使用頻率,但卻各有特點。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA,CTAB 可以從含多糖的裂解體系中將核酸沉淀下來。PEG 是沉淀病毒顆粒的方便手段。

5、 怎樣去洗滌沉淀?

洗滌首先一定要將沉淀懸浮起來;第二就是要有一定的時間,尤其是當核酸沉淀比較大時 (使核酸沉淀最終蓬松);第三是少量多次;第四則是去上清要徹底。教科書中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水紙上片刻”,這一描述本身沒有問題,且十分方便,但因為他來自國外,自然就有了“水土不服”的問題。如果離心管是經過硅化的,因為液體幾乎不掛壁,所以上清可以去除得非常徹底;好的管子,即使沒有經過硅化,殘留量也非常少,也沒有什么問題;差的管子,液體的掛壁非常可觀,其殘留量多到會影響后續的實驗。唯一不受管子質量影響的操作,就是倒掉液體后再短暫離心,將殘液用移液器吸出。一定要牢記的是,殘液中都含有上一步操作中的雜質,其殘留量與混勻程度、核酸沉淀的大小都有關。揮發時去掉的是乙醇,雜質是不會被揮發去除的。另外,核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強度。沉淀越大,裂解液的裂解能力越強,洗滌越要徹底:放置時間相對要長一點,洗滌次數也要考慮增加。最關鍵的,洗滌一定要用室溫的 75% 乙醇。

6、 怎樣保存核酸?

純化后的核酸,最后多使用水或者低濃度緩沖液溶解;其中 RNA 以水為主,DNA 則多以弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解。經典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解,認為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來的 DNase 降解的風險;如果操作過程控制得當,DNase 的殘留幾乎是可以忽略的,完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。基本上,核酸在保存中的穩定性,與溫度成反比,與濃度成正比。如果溫度合適,保存中核酸發生降解或者消失,首要原因是酶殘留導致的酶解,第二個原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適導致的水解 (RNA 在弱酸性更穩定,而 DNA 在弱堿性更合適)。還有一個不為人重視的,就是 EP 管對核酸的影響。首先一定要堅信一點,那就是核酸一定會與裝它的容器的接觸面發生反應,達到某種均衡。EP 管的材質,首先可能吸附核酸,其次還可以誘導核酸的結構發生某些變化,如變性。在核酸的濃度比較高時,這個現象可能觀察不到;當核酸濃度很低時,則比較明顯了。如抽提的質粒電泳的構型越來越多,除了原來的三種帶型外,還可能出現 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等帶型。在低濃度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以穩定核酸,雖然已經為實驗所證明,但許多實驗人員并沒有將該建議當回事。

7、 核酸質量檢測

將抽提好的核酸直接用于后續的實驗,是唯一可靠的檢測方法;除此之外的檢測方法,都是相對的,而且并不十分可信。目前用于正式實驗前檢測核酸質量的方法,一是電泳,二是紫外分光光度儀。電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小,只要核酸不是太小或者太大 (超出電泳分離范圍),該方法還是非常可信的;電泳還可以用于估計核酸的濃度,但其準確度與經驗有關;另外,電泳也可能提供某些雜質污染的信息,但是同樣與經驗有關。紫外分光光度儀檢測的是純度和核酸含量,然而,由于紫外分光光度儀不能確保非常準確,而該儀器的靈敏度又非常高,所以,提供的結果并不十分可信。一般講,同時進行紫外和電泳檢測,綜合二者的結果,可以做出一個更合理的判斷。但由于這兩個方法都有缺陷,所以,即使出現壞的結果能用于后續實驗而好的結果卻不能用于后續實驗,也不用大驚小怪。


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