PCR常見問題分析之一

發布時間:2017-07-27

1  PCR產物的電泳檢測時間 
  一般為48h以內,有些最好于當日電泳檢測,大于48h后帶型不規則甚致消失。

 

2  假陰性,不出現擴增條帶,應該怎么辦? 
  PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備,②引物的質量與特異性,③酶的質量及用量, ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

 

3  出現假陽性怎么辦? 
  出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致,有時其條帶更整齊,亮度更高。 
  引物設計不合適:選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進行PCR擴增時,擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現假陽性。需重新設計引物。 
  靶序列或擴增產物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個基因組或大片段的交叉污染,導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外,所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及進樣槍頭等均應一次性使用。必要時,在加標本前,反應管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,與引物互補后,可擴增出PCR產物,而導致假陽性的產生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。 

4  出現非特異性擴增帶怎么辦?

PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致,或大或小,或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現,其原因:一是引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環次數 過多有關。其次是酶的質和量,往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶 則不出現,酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有:必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量,適當增加模板量,減少循環次 數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。

 

4.1  怎樣檢測引物是否合成的好?

可以在DHPLC上看一下,80度全變性的情況下一條帶就可以了。如果合成的不好,產物自然不特異了。 

4.2  使用了比較好的Taq酶,且引物沒有出現問題,考慮如下幾點: 
  1。模板是否過量? 
  2。退火溫度是否可降高1-2度? 
  3。Mg的濃度控制在1.5mM?  

5  出現片狀拖帶或涂抹帶怎么辦? 
  PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量 差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環次數過多引起。其對策有:減少酶量,或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量,減少循環次數。

 


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