PCR常見問題分析之二/克隆

發布時間:2017-07-27

克隆PCR產物的最優條件是什么? 
最佳插入片段:載體比需實驗確定。1:1(插入片段:載體)常為最佳比,摩爾數比1:8或8:1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶,插入片段共10ul。室溫保溫1小時,或4℃過夜。在這2種溫度下,缺T-凸出端的載體會自連,產生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數克隆要求,為提高連接效率,需4℃過夜。 

2  PCR產物是否需要用凝膠純化? 
如凝膠分析擴增產物只有一條帶,不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶,可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高,這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆,而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。 

3  如果沒有回收到目的片段,還需要作什么對照實驗? 
A)涂布未轉化的感受態細胞。 
如有菌落,表明氨芐失效,或污染上帶有氨芐抗型的質粒,或產生氨芐抗型的菌落。 
B)轉化完整質粒,計算菌落生長數,測定轉化效率。 
例如,將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后,用100ul鋪板。培養過夜,產生1000個菌落。轉化率為: 產生菌落的總數/鋪板DNA的總量。 
鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA,用SOC稀釋到1000u后含10 ngDNA,用1/10鋪板,共用1 ng DNA。轉化率為: 
1000克隆X10(3次方) ng /鋪板1 ng DNA ug=10(6次方)cfu/ ug 
轉化pGEM-T應用10(8次方)cfu/ ug感受態細胞 
如沒有菌落或少有菌落,感受態細胞的轉化率太低。 
C)如用pGEM-T正對照,或PCR產物,產生>20-40藍斑(用指定步驟10(8次方)cfu/ ug感受態細胞),表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶(M1801,M1804,M1794)質量標準好無核酸酶污染,不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。 
D)用pGEM-T或pGEM-T Easy載體,連接pGEM-T正對照,轉化高頻率感受態細胞(10(8次方)cfu/ug),按照指定的實驗步驟,可得100個菌落,其中60%應為白斑,如產生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落,連接有問題。


4  對照實驗結果好,卻沒有回收到目的片段,實驗出了什么問題? 
A)連接用室溫保溫1小時,能滿足大多數克隆,為提高效率,需4℃過夜。 
B)插入片段帶有污染,使3`-T缺失,或抑制連接,抑制轉化。為此,將插入片段和pGEM-T正對照混合,再連接。如降低了對照的菌落數,插入片段需純化,或重新制備。如產生大量的藍斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。 
C)插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段,因受UV過度照射,時有發生。UV過度照射會產生嘧啶二聚體,不利于連接,DNA必需重新純化。 
D)帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A,后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料(TM042)。 
E)高度重復序列可能會不穩定,在擴增中產生缺失和重排,如發現插入片段高頻率地產生缺失和重排,需用重組缺陷大腸桿菌菌株,如SURE細胞

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