DNA電泳常見問題分析之一

發布時間:2017-07-27

1  請問配制聚丙烯酰胺凝膠電泳膠時,促凝的是TEMED還是過硫酸銨?膠聚時間很長如何解決?

過硫酸銨提供驅動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所需的自由基,而TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速它倆的聚合。膠聚合時間長可能是TEMED失效了,過硫酸銨固體時間過久也會失效的。
一個讓PAGE膠很快聚合的方法:
不要先配AP(過硫酸銨)溶液,因為AP很容易變質。在保證TEMED和AP質量的情況下,每次配膠時,直接稱一定量的AP粉劑溶入液體狀態的PAGE中,這樣可以保證AP的催化能力,而且可以多加一點。配25ml的PAGE膠,加0.03克AP粉劑,最后加入25ulTEMED,20分鐘左右就可以凝固(當然這個時候拔梳子,會有少量未凝固的PAGE在孔里形成絲狀干擾,使加的樣品看起來不太漂亮,但一般不影響跑膠效果和條帶的形狀和位置)。  

2  DNA電泳的MARKER怎么是扭曲的?
1、 配制膠時的緩沖液需要和電泳緩沖液不是同時配制的.最好是同時配制.電泳時緩沖液高過液面1-2mm即可。
2、 電泳時電壓過高,可以在電泳前15分鐘用較低電壓(3V/cm),等條帶出孔后比較漂亮了.然后再調電壓。
3、 上樣時盡量慢慢加樣,等樣品自然沉降后再加電壓。

3  跑出的DNA帶模糊?
1、 DNA降解:避免核酸酶污染。
2、 電泳緩沖液陳舊:電泳緩沖液多次使用后,離子強度降低,pH值上升,緩沖能力減弱,從而影響電泳效果。建議經常更換電泳緩沖液。
3、 所用電泳條件不合適:電泳時電壓不應超過20V/cm,溫度<30℃;巨大DNA鏈電泳,溫度應<15℃;核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。
4、 DNA上樣量過多:減少凝膠中DNA上樣量。
5、 DNA樣含鹽過高:電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。
6、 有蛋白污染:電泳前酚抽提去除蛋白。
7、 DNA變性:電泳前勿加熱,用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。

4  有不規則DNA帶遷移?
1、 對于λ/Hind III片段cos位點復性:電泳前于65℃加熱DNA 5分鐘,然后在冰上冷卻5分鐘。
2、 電泳條件不合適:電泳電壓不超過20V/cm;溫度<30℃;經常更換電泳緩沖液。
3、 DNA變性:以20mM NaCl Buffer稀釋DNA,電泳前勿加熱。

5  跑出的DNA條帶帶弱或無DNA帶?
1、 DNA的上樣量不夠:增加DNA的上樣量;聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高,上樣量可適當降低。
2、 DNA降解:避免DNA的核酸酶污染。
3、 DNA走出凝膠:縮短電泳時間,降低電壓,增強凝膠濃度。
4、 對于EB染色的DNA,所用光源不合適??應用短波長(254nm)的紫外光源。

6  跑出的DNA帶缺失不完整是怎么回事?
1、 如果是小DNA帶走出凝膠,可以縮短電泳時間或降低電壓或增強凝膠濃度。
2、 分子大小相近的DNA帶不易分辨??增加電泳時間,核準正確的凝膠濃度。
3、 DNA 變性:電泳前請勿高溫加熱DNA鏈,以20mM NaCl Buffer稀釋DNA。
DNA鏈巨大,常規凝膠電泳不合適??在脈沖凝膠電泳上分析。

7  做PCR電泳后跑電泳,目的基因是489BP的,結果每次切膠回收后再跑電泳就變成500多了,快到600了?為什么?

有時只靠電泳結果判斷是不準確的,同樣的片段每次跑的遠近會有不同。有經驗顯示目的片段是1300多,結果就跑到1000的marker下面去了,后來證實片段沒有問題。也有做的一個片段也是這樣,是490BP.理論上兩個條帶一樣,可是PCR結果顯示就是大小不一致。然后回收以后的檢測結果又全部都一樣了,后來又拿去做了下一個測序,才知道根本沒有問題。

8  跑完PCR,暫時不方便膠回收,條帶已經切下來放到ep管里了,這個能保存么?會不會有不良影響?

還有個問題,pcr的產物可以不可以直接拿來做模板再進行pcr。我試過,可是總是出現一個拖尾亮條,沒有帶,是什么原因呢?
割下來的膠放在-20保存兩個星期完全沒有問題。切下來的膠放在4度冰箱中4、5小時沒有問題回收的效果也很好。

9  凝膠回收DNA實驗的關鍵在哪里?
最關鍵的是切膠之后,溶膠的那一步.切膠的時候要盡量把多余的瓊脂糖凝膠切干凈,按照實驗步驟,第一步應該是將膠充分的溶化.這以后步一定要做充分,保證凝膠已經完全溶解了.加乙醇這步也很關鍵,當凝膠溶解后最好多過幾次柱子。還有就是洗脫的那一步。洗脫的時候最好用加熱到60度 的洗脫液洗脫,如果實在效果不好可以分兩次洗脫。

10  切膠的時候如何能切的準呢?條帶的位置肉眼很難判斷出來,如何判斷條帶的位置呢?
可以將產物與Marker一起電泳,染色后,在紫外燈下觀察結果,跟Marker進行相比,就知道要的是哪條帶。注意,紫外燈下切膠速度要快,否則DNA會降解,另外,紫外線對身體傷害很大,特別是眼睛,請注意采取保護措施(比如在專門的箱子里切,帶眼鏡等)。RNA 用具要用10%的NaOH浸泡過液,再用DEPC水沖洗干凈  70%的乙醇用過 國產分析乙醇有雜質,RNA酶還會有,并帶入其它污染。


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