怎樣在線做PCR引物設計

發布時間:2017-07-27

要先對PCR目的序列的長度有個大致估計:

第一步:找到Primer3的站點。你不用記住這個站點,但是要記住“Primer3”這個詞,然后打開GOOGLE首頁,輸入Primer3,跳出來的第一個項目就是了“Primer3 Input 0.4.0 (primer3-web/htdocs/input-040.htm)

網址是http://frodo.wi.mit.edu/

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第二步:貼上模板序列。進入Primer3站點,可以看到一個引物設計的界面。在“Paste source sequence below (5'->3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖進去。注意是5'->3'方向的,數字或者空格都沒關系,軟件會自動過濾的。

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第三步:重要參數設定。首先是“Product Size Ranges”,如果你不希望軟件給你隨便做的話,首先要調整的就是這個參數。默認的參數實際上是從100到1000,這個你得自己改,如果你希望產物的大小符合你的預期,盡可能把范圍改小,比如480-500,具體看情況調整。第二個參數是Primer Size”,默認值一般可以用,但是,當你用熟了這個軟件,你自己就知道該怎么改了。第三個參數是Primer Tm”這個和Primer Size差不多。

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第四步:Pick primers: 點一下這個按鈕,符合你大小預期的primer就出來了,看看Primer3 Output的界面,多么漂亮!你要的primer出來了,而且有primer在序列上的位置比對圖,還要primer本身的信息,包括位置,長度,Tm,GC含量,任何位置互補堿基數,3'端互補堿基數,以及引物序列,(注意,下游引物是5'->3'),還要產物大小,兩引物間任意互補堿基數,兩引物間3'端互補堿基數等。如果引物尚在參數設定的范圍內,但還不是最佳,將會給出警告。

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第五步:引物設計檢驗:可以僅僅設計一向引物,只要在Pick left primer或者Pick right primer前面的勾勾掉一個就可以。也可以自己定義引物,放在Primer框里,(注意,下游引物的書寫反向仍然是5'->3')如果符合設定的條件,軟件將對給出引物評分,同時給出警告信息,根據警告信息可以適當對自定義引物做些調整即可,警告信息也讓你做實驗的時候心中有數。對于文獻發表的引物,最好都要檢查一下,這樣就可以避免被別人有意無意誤導。至于RT-PCR所用的引物,最好是使得產物跨過內含子,這樣避免潛在DNA對RT-PCR的干擾。實際做引物的時候,要把內含子都去掉,僅僅把外顯子序列放入源序列框中,并且通過自定義引物設計的方法,使上下游引物分別全部或者部分落在不同外顯子上。至于如何快速識別內含子和外顯子以及電子PCR,我將抽空另做說明。

至于設計出來的引物的實際效果,根據我的經驗,一般情況下都能做到PCR一次成功,也許隨便那一段序列做引物也能達到很好的效果,但是不管怎么說,軟件做引物可以讓自己心中有數。最后,GOOD LUCK TO EVERYONE.


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