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V5007L V5008L 2X One Step Prime RT-qPCR Mix (凍干粉)

一步法多重熒光定量PCR的試劑
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V5007L/200 rxn, 25 μl/rxn V5008L/5000 rxn, 25 μl/rxn

貨號:V5007L, V5008L

 

產品組成 

Component

V5007L (200 rxn, 25 μl/rxn)

V5008L (5000 rxn, 25 μl/rxn)

One Step Prime RT-qPCR Enzyme MixLyophilized *

100 rxn × 2

100 rxn × 50 

Enzyme Mix Buffer (2X)

1.25 ml × 2

1.25 ml × 50

*包含逆轉錄酶,RNase抑制劑,熱敏UDG酶,熱啟動DNA聚合酶,dNTPs包含dUTP

 

保存條件

2~8

 

產品簡介

2X One Step Prime RT-qPCR Mix 是用于一步法多重熒光定量PCR的試劑。它以探針和特異性引物來定量檢測RNADNA靶標序列。優化的緩沖液組分可以協助在一個體系內完成多達4RNADNA序列的多重定量PCR
該混合液以
2倍濃度提供,能夠加入更多的模板進行反應,從而提高檢測的靈敏度。凍干One Step Prime RT-qPCR Enzyme Mix試劑將耐熱逆轉錄酶、熱啟Taq DNA聚合酶、熱敏UDG酶、dNTPs等做成凍干品試劑,制品性能穩定,可長期保存。

應用舉例

1. 準備Master Mix

取出凍干的One Step Prime RT-qPCR Enzyme Mix,平衡室溫后取1支凍干粉溶解1.25 ml Enzyme Mix Buffer避免產生氣泡。吹打清洗管壁,防止凍干粉殘留將管子放在一邊30 min

注意:重懸的Master Mix可以在-20℃保存 1年,4℃ 保存7天。

 

2. 準備反應體系 

2.1 按下表于冰上配置反應體系。于冰上融化所有試劑。配制多個反應孔時,請為各組分預留10%的余量,以免移液損失。

2.2反應體系配好后,用光學貼膜覆蓋反應板,充分翻轉混勻,離心。

快速反應體系:

組分

體積

終濃度

重懸Master Mix

12.5 μl

1X

引物-探針

1 μl

引物:400-900 nM

探針:100-250 nM

樣品*

根據需要調整

1 pg-100 ng

RT-PCR級超純水

根據需要調整

總體積

25 μl

 

標準反應體系:

組分

體積

終濃度

重懸的Master Mix 

25 μl

1X

引物-探針

2 μl

引物:400-900 nM

探針:100-250 nM

樣品*

根據需要調整

1 pg-100 ng

RT-PCR級超純水

根據需要調整

總體積

50 μl

* DNA RNA 樣本均可,逆轉錄反應并不會對 DNA 樣本造成影響。

 

3. 運行 RT-qPCR 反應程序

快速反應體系: 

步驟

階段

循環數

溫度

時間

逆轉錄

1

1

55°C *

10 min

預變性

2

1

95°C

2 min

擴增

3

45

95°C

5 sec

60°C

30 sec 

 

標準反應體系: 

步驟

階段

循環數

溫度

時間

逆轉錄

1

1

55°C *

10 min

預變性

2

1

95°C

2 min

擴增

3

45

95°C

15sec

60°C

60 sec 

* 逆轉錄反應的溫度可以在 4855之間進行調整

 

4. 實驗數據分析

針對不同的儀器類型,數據分析也略為不同。一般情況下,數據分析主要包括:

1.觀察擴增曲線,根據需要進行設置,比如:

a.設置合適的基線和閾值線

b.將一些典型的異常值從分析中剔除掉

2.在孔位表或者結果表中,觀察復孔之間的 Ct 值是否有差異;

3.對于絕對定量,觀察標準曲線的斜率、擴增效率、R2值、截距、Ct 值和異常值。




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