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HS Kit(P3082)

價格: 286.00

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P3082(1 ml×5(200次,50 μl體系/次))

HS? Kit

Cat. #P3082

產品簡介

HS?  Kit包含濃縮PCR擴增預混和溶液(含有dNTP混合物、緩沖液等)和一支Taq DNA聚合酶。使用時,僅需將反應緩沖液與Taq DNA聚合酶按比例混合后,在擴增體系中加入模板和引物即可進行PCR,大大簡化操作過程,縮短操作時間,降低污染(加樣次數減少)同時,由于體系內含有增強劑,能夠顯著增強PCR擴增的靈敏度。

HS? Taq DNA聚合酶(高特異性Taq DNA聚合酶)是針對普通 Taq DNA聚合酶靈敏度高,易產生非特異性條帶的情況,專門研制的高特異性嗜熱DNA聚合酶產品。本產品的反應緩沖液的離子種類和濃度都經過改良,使得引物與模板的特異性結合力顯著增強,從而提高引物與模板結合的嚴謹性,減少非特異性擴增。實驗數據證明HS? Taq DNA聚合酶能顯著提高PCR擴增的特異性,降低背景,又能對長片段有較高的擴增效率。延伸速度為1min/kb70~75℃,簡單模板可達10s/kb)。該酶具有5'→3'聚合酶活性,無3'→5'外切酶活性。擴增產物具有3'-dA,可直接用于TA克隆。

產品組成

Component

P3082

HS? Reaction Mix 

1 ml×5

HS? Taq DNA聚合酶(2.5U/μl

160 μl

本產品分含體系中包含溴酚藍、不含溴酚藍兩類。體系中包含溴酚藍的產品,PCR擴增產物可直接電泳檢測。這兩類產品的擴增性能無差異。如沒特別說明提供體系中包含溴酚藍的包裝。

活性定義

一個活性單位(U)指用活性化的大馬哈魚精子DNA作為模板/引物,在72℃30 min內,攝入10 nmol全核苷酸所需的酶量。

保存條件

-20℃保存2年。

質量控制

純度檢測:經質量檢測,產品不含脫氧核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能檢測:PCR方法檢測無宿主殘余DNA,能有效擴增人基因組中的單拷貝基因。

應用舉例

1. 配制反應體系

請于冰上配置反應體系,體系大小與組分用量與添加順序可調整:

Ordinal

Component

Volume

(50 μl reaction volume)

Final   concentration

(50 μl reaction volume)

1

2× HS? Reaction Mix

25 μl

2

upstream primer (10 μM)[1]

2 μl

0.4 μM

3

downstream primer (10 μM)[1]

2 μl

0.4 μM

4

HSTM Taq DNA聚合酶(2.5U/μl[2]

0.5-1 μl

1.25U-2.5U

5

template DNA[3]

1-4 μl

<1μg

6

超純水[4]

To 50 μl

-

optional

MgCl2(MgSO4)/PCR Enhancer[5]

Variable

-

[1] 引物終濃度建議范圍:0.1-1 μM。特異性差時可降低濃度,效率低時可提高濃度。

[2] 根據目的片段擴增的難易程度調整DNA聚合酶的用量。

[3] 不同模板最佳用量不同,部分DNA模板建議用量如下表(50 μl反應體系)。

Template

Dosage

人類基因組DNA

0.1μg-1μg

λDNA

0.5ng-5ng

大腸桿菌基因組DNA

10ng-100ng

質粒DNA

0.1ng-10ng

[4] 可單獨訂購超純水(Cat. #P9021/P9022/P9023)。

[5] 可單獨訂購25mM MgCl2Cat. #P9031)和PCR EnhancerCat. #P9041)。

2. 設定反應程序進行PCR反應

Stage

Temperature

Time

Number of Cycles

Initial Denaturation

94℃

3 min

1

Denaturation

94℃

30 sec

25-35

Annealing

55-68℃[1]

30 sec

Extension

72℃

Variable[2]

Final Extension

72℃

5-10 min

1

[1] 退火溫度應根據Tm值較低的引物來設。

[2] 延伸時間按1min/kb來設最佳(簡單模板可達10s/kb)。

3. 分析結果

反應產物可直接進行瓊脂糖凝膠電泳,通過凝膠成像設備觀察目的條帶的擴增情況。如有需要,可進行割膠回收。無產物或產物量少的改進措施有:1調整退火溫度;2減少抑制劑的影響,如提取的基因組DNA中含有抑制擴增的成分,需要高倍稀釋(1:10000)后使用;3采用乙醇沉降洗脫,提高模板DNA的純度;4使用PCR添加劑,如PCR EnhancerCat. #P9041MgCl2Cat. #P9031等可提高產量。

操作注意事項

建議在冰上配置PCR 反應液后,再放入PCR儀中進行擴增。這有利于提高擴增的特異性,減少非特異性擴增,得到良好的PCR結果。

引物設計注意事項

引物長度一般在15-30個堿基之間;上下游引物3’末端避免互補,避免出現3個以上重復的GC,或出現發夾結構,否則會產生非特異性擴增;GC含量控制在40-60%,且上下游引物GC含量盡量接近;Tm值控制在55-65℃之間,且上下游引物Tm值盡量接近,額外附加序列(酶切位點、修飾等)是非模板匹配序列,不參與Tm值計算。

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名稱

貨號

規格

PCR Mix

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更多PCR酶、DNA Marker及核酸提純類產品請登錄東盛生物官網查詢。

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